慢病毒包装系统

慢病毒颗粒的生产和转导

慢病毒颗粒生产和转导流程示意图

质粒纯化和细胞培养
1. 准备高质量质粒 DNA。
2. 转染前 18-24 小时,将 2.5x10^6 个 293T 细胞置于 10cm 培养皿中并在 37℃ 孵育过夜。细胞应在 24 小时内达到 65%-70% 的融合。

转染 293T 细胞
3. 将转移载体和包装质粒加入 Opti-MEM 中,通过完全移液来混合。
4. 将转染试剂加入同一试管中,涡旋 10 秒钟。
5. 在室温下孵育混合物 15 分钟。
6. 将混合物逐滴添加到培养皿中,并涡旋以均匀分散在培养皿中。将培养皿放回到 37°C 的细胞培养箱中。

收集病毒上清液
7. 孵育 12-18 小时后,更换培养基并继续培养 48 小时。
8. 将细胞培养上清液转移到15mL离心管中。3000g,离心 15 分钟,并通过过滤器(0.45 微米)过滤上清液。将病毒上清液转移到新管中。
9. 病毒颗粒制备完成,待用。它们可以在 4℃ 下储存 2 周,或等分后长期储存在 -80℃。

慢病毒转导
10. 在 24 孔板中将每孔 50,000 个靶细胞铺板至转导后达 50% 的融合效率。
11. 从孔中移出培养基并加入适量的慢病毒颗粒、培养基、聚凝胺(可选)。轻轻涡旋以混匀。(可选:将不断加量的病毒以不同的 MOI(5、10 和 20 等)加入到不同孔中以优化转导)。
12. 转导后 72 小时,病毒基因组将整合到宿主细胞基因组中。收集细胞并进行 qRT-PCR 或 Western 印迹或流式细胞术。

慢病毒包装载体

转移载体
慢病毒转移质粒含有目的基因。转基因序列侧翼为长末端重复(LTR)序列,其促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。北京义翘神州的转移质粒是含有特定元件以改善转基因表达,病毒滴度和生物安全性的优化载体。除产生高表达水平外,转基因表达的启动子是增强型 CMV 启动子。cPPT 元件增强转导效率,WPRE 增强转基因的表达,并增加病毒滴度。 出于安全原因,转移质粒不能复制,并且在 3'LTR 中存在序列缺失,从而在整合后使病毒"自灭活"(Self-inactivating, SIN)。

包膜载体
VSV-G 包膜质粒含有水泡性口炎病毒(VSV-G)包膜基因的 G 蛋白。与 HIV 包膜不同,VSV-G 包膜具有广泛的细胞宿主范围,包括可被表达 VSV-G 的慢病毒转导的广泛的细胞类型。REV 质粒含有 HIV 复制所需的调节蛋白 rev。

包装载体
包装质粒包含编码产生慢病毒所需的一些蛋白质的结构(gag)和复制(pol)基因。还包括病毒 env 基因,其编码定义趋向性(即可感染细胞的范围)的包膜蛋白。
包膜质粒和包装质粒提供转录及并将表达载体的 RNA 拷贝包装成重组假病毒颗粒所必需的所有蛋白质。

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