CAR-T 细胞质量检测

CAR-T 细胞质量检测概述

CAR-T 细胞回输到患者体内前需经过严格的放行检测。CAR-T 细胞的质量检测主要包括生化检测、微生物检测和细胞学检测。生化检测主要用于 CAR-T 的鉴别和纯度检测;细胞学检测主要是细胞计数、活率检测、体外效价检测(ELISA 检测试剂盒)等;微生物检测主要进行总厌氧菌计数、酵母和霉菌检测等。CAR-T 细胞质量的优劣直接影响临床治疗效果和患者的健康,如不进行严格检测,甚至会危及患者的生命。CAR-T 的效价检测可以用细胞因子 ELISA 检测试剂盒来实现,通过检测代表性细胞因子的表达来评估 CAR-T 细胞对靶细胞的杀伤活性和特异性。CAR 表达水平可以通过流式细胞术检测 CAR 阳性 T 细胞的百分比来评估。

CAR-T 细胞质量检测之流式抗体

流式细胞术作为一种在功能水平上对单细胞进行定量分析和分选的检测手段,可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好等诸多优势,是判断 CAR-T 细胞活性和组分的一种重要方式。如全球首个获得 FDA 批准上市的 Kymriah 作为一款基于基因改造的靶向 CD19 的自体 T 细胞免疫疗法,在其治疗过程中,常通过流式细胞术检测 CD19 CAR 的表达来评估基因编辑同种异体 CD19 CAR-T 细胞的制备成功率。

利用 CD19 CAR 能特异性结合 CD19 蛋白的特性,如果待检 T 细胞正常表达了 CD19 CAR,生物素标记的 CD19-Fc 蛋白就能被标记到待检 T 细胞表面;利用生物素能特异性结合亲和素(Streptavidin-PE)和 Anti-CD3-BV711 抗体能特异性结合 CD3 分子的特性,如果待检 T 细胞表面有生物素和 CD3 分子,链霉亲和素上的 PE 和 Anti-CD3 抗体上的 BV711 荧光标记就能被标记到待检 T 细胞表面;将制备好的单细胞悬液上机进行流式细胞分析。检测结果显示,CD3 阴性 T 细胞群中 CD19 CAR 表达的比例要高于 CD3 阳性 T 细胞群。

流式细胞术检测 T 细胞表面 CD3 分子和 CD19 CAR 表达的原理示意图
图1. 流式细胞术检测 T 细胞表面 CD3 分子和 CD19 CAR 表达的原理示意图

CAR-T 细胞质量检测之 ELISA 试剂盒

细胞因子的检测是指示 CAR-T 细胞活性的主要方式之一。在某些情况下 CAR-T 细胞在靶向杀死癌细胞时能够快速产生超大量的细胞因子,即细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome, CRS)也叫细胞因子风暴,它们可以激活更多的免疫细胞来应对癌细胞,从而引起惊人的免疫效应,杀伤癌细胞的同时也具有潜在危险性。通常应用细胞因子 ELISA 试剂盒检测 CAR-T 细胞的杀伤活性和特异性。如用 ELISA 技术检测靶向肝癌的 GPC3-CAR-T 细胞,研究表明,与 GPC3 阳性 Huh-7 肝癌细胞共培养的肝癌 GPC3-CAR-T 细胞分泌干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ 或 IFNG)的水平比 Mock 组高效。我们知道,IFN-γ 是一类分泌型糖蛋白,具有抗肿瘤和免疫调节的作用。实验结果同样显示 GPC3-CAR-T 细胞具有高效杀伤 GPC3 阳性肝癌细胞的能力,为进一步推进 GPC3-CAR-T 的肝癌临床研究奠定基础。

CAR-T 细胞质量检测相关产品列表

T 细胞流式抗体部分产品列表:

分子 抗体名称 标记类型 抗体类型 靶点种属
CD3E  CD3e / CD3 epsilon Antibody APC, PerCP, FITC, PE Mouse MAb Human
CD4 CD4 Antibody APC, PerCP, FITC, PE Mouse MAb Human
CD8A  CD8/CD8 alpha/Leu-2 Antibody APC, FITC Mouse MAb Human
IL-18R IL18R1 Antibody APC, FITC, PE Mouse MAb Human
CD26  DPP4 / CD26 Antibody PE, APC, FITC Mouse MAb Human
TNF-α  TNF-alpha / TNFA / TNFSF2 Antibody FITC Mouse MAb Human
TNF-α  TNF-alpha / TNFA / TNFSF2 Antibody APC, FITC, PE Rabbit MAb Human
IFN-gamma Interferon Gamma/IFN gamma/IFNG Antibody APC, PerCP, FITC, PE Rabbit MAb Human
CD45RA CD45RA Antibody FITC, PE Mouse MAb Human
CD62L CD62L / L-Selectin / SELL Antibody APC, PerCP, PE Mouse MAb Human
CD38 CD38/ADPRC1 Antibody APC, PerCP, FITC, PE Mouse MAb Human
CD25  IL2RA/IL-2RA/CD25 Antibody FITC, PE Mouse MAb Human
CD25 IL2RA / IL-2RA / CD25 Antibody APC, PerCP, FITC, PE Rabbit MAb Human
CD127 IL7R / IL-7R / CD127 Antibody APC, PerCP, FITC, PE Rabbit MAb Human
CD73 CD73 / NT5E Antibody FITC, PE Mouse MAb Human

细胞因子 ELISA 试剂盒相关部分产品列表:

分子 货号 样本适用类型 最低检测限 (pg/mL) 线性范围 (pg/mL)
TNF KIT10602 PBMC 上清液 11.96 23.44-1500
IFNG KIT11725A PBMC 上清液 6.5 13.28-850
IL4 KIT11846 PBMC 上清液 2.54 10.94-700
IL6 KIT10395A 血清 , PBMC 上清液 0.69 3.13-200
IL10 KIT10947 PBMC 上清液 14.37 23.44-1500
CSF2 KIT10015  PBMC 上清液 2.04 7.81-500
CXCL9 KIT10888 血清 11.96 23.44-1500
CCL2 KIT10134 血清 , 尿样 1.9 3.91-250
IL13 KIT10369 PBMC 上清液 0.59 4.69-300
IL7 KIT11821 PBMC 上清液 1.89 6.25-400
IL17A KIT12047 PBMC 上清液 0.58 1.88-120
CRP KIT11250 血清 12.8 46.88-3000
IL32 KIT11064  血清 19.2 62.5-4000
TGFB1 KIT10804  血清 23.2 46.9-3000
TNF-beta KIT10270  PBMC 上清液 3.13 7.82-500
IL-12 KITCT011  PBMC 上清液 12.93 39.07-2500

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参考文献

1. 吴斯玮,敖翔等. 靶向肝癌的 GPC3-CAR-T 细胞的构建与功能鉴定. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2017; 24(7):573–580

2. Zhang X1, Lv X2, Song Y. Short-term culture with IL-2 is beneficial for potent memory chimeric antigen receptor T cell production. Biochem Biophys Res Commun. 2018; 495(2):1833-1838

3. Daniel T MacLeod, et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells. Molecular Therapy. 2017; 25(4):949-961