绿色荧光蛋白 GFPSpark®

绿色荧光蛋白是能在蓝色光照下产生绿色荧光的蛋白质(GFP)。GFPSpark® 是绿色荧光蛋白 EGFP 的一个增强型突变体。GFPSpark® 包含有 245 个氨基酸,分子量为 26.8 kDa。GFPSpark® 的激发波长是 487 nm,发射波长是 508 nm。它有更亮的绿色荧光信号,比其他绿色荧光更容易观察。比 EGFP 的成熟时间短,能更早的检测到荧光信号。这些特性决定了 GFPSpark® 能很好的应用于多个领域研究。例如 GFPSpark® 可作为细胞内基因表达的报告基因,研究基因表达调控。无需其他操作,不需要底物和辅助因子,利用蓝光激发就可以检测到它的表达。可以构建各种缺省了启动子或增强子序列的载体,用荧光测定组织特异性启动子和特殊的增强子。GFPSpark® 可作为其他蛋白的分子标记,与其他蛋白融合表达,监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育等。

绿色荧光蛋白 GFPSpark® 的优势

更亮的绿色荧光 pH 值稳定性好 快速成熟 自主研发
光稳定性强 推荐用于基因表达分析,细胞器和亚细胞结构标记
  • GFPSpark® 荧光图谱
  • SDS-PAGE 凝胶电泳分析
  • GFPSpark® 产品图片

与 EGFP 相比,GFPSpark® 具有更强的荧光

GFP Improved EGFP Optimized GFPSpark®
较亮 更亮

GFPSpark® 的主要特性

  荧光颜色 消光系数
(M-1cm-1)
量子产率 光强 Pka 结构 30℃条件下成熟速度 漂白t1/2 (s)
GFPSpark® 绿 47000 0.62 29.14 4.5 单体 12.4
EGFP 绿 39000 0.6 23.4 5 单体 9.2

荧光光谱特征

A)消光系数:

B)光强:

用 Varian Cary Eclipse 测量绿色荧光光谱,用 Cary UV-Vis 测量 GFPSpark® 量子产率和吸收光谱。用分光光度计测定消光系数和天然蛋白吸光度,用 BCA 法测定蛋白质浓度。GFPSpark® 的激发光谱为 487 nm,发射光谱为 509 nm。GFPSpark® 量子产率为 0.62,EGFP 量子产率为 0.60。GFPSpark® 消光系数为 47000,EGFP 消光系数为 39000。 GFPSpark® 的消光系数优于 EGFP。

成熟时间

荧光蛋白样品在变性溶液(8M尿素,1mM二硫苏糖醇)中加热至95℃ 并保持4分钟,然后在稀释 100倍 的复性缓冲液(35mM KCl,2mM MgCl 2,50mM Tris pH 7.5, 1mM二硫苏糖醇)开始重折叠反应。在成熟测定中,将现配的 5mM 的连二亚硫酸盐加入到变性溶液中(Reid&Flynn,1997)。由于连二亚硫酸盐在高温下的不稳定性并能使发色团的还原,将样品冷却到 25℃ ,加入 5mM 连二亚硫酸盐,然后再次加热到 95℃ 。蛋白质重新折叠和成熟后在 25℃ 条件下用 Varian Cary Eclipse 荧光分光光度计测量荧光的回收率。半折叠时间 GFPSpark® 是270s, EGFP是570s。半成熟时间 GFPSpark® 是1305s , EGFP是1560s。GFPSpark® 成熟快于 EGFP。

pH 稳定性

GFPSpark® pH 的稳定性用96孔板进行试验。取100 µl 溶解在弱缓冲液中的GFPSpark® 绿色荧光蛋白,加到100 µl 的强酸碱缓冲液中(总体积为200µl)。测试 pH 值从3到12,每个 pH 做3个孔的平行试验,测定每个孔的荧光亮度。最佳 pH 条件下荧光亮度的 50% 荧光值所对应的 pH 为 GFPSpark® 的 pKa。GFPSpark® 的pKa是4.5,EGFP 的 pKa 是5。 GFPSpark® 的 pH 稳定性优于 EGFP。

光漂白试验

用激光扫描共焦显微镜(LSCM)对 GFPSpark® 进行光漂白实验 。用表达载体瞬时转染 HeLa 细胞,36h 后拍照。然后使用 60x 油镜(CFI Apo TIRF,NA = 1.49)进行光漂白,将激光(488nm)调节至 8mW 的输出功率。仪器(A1,Nikon)被设置为 60X 的变焦,23.94μm2(5.7μm×4.2μm),80V 的光电倍增管电压,扫描时间为每帧1.5秒。细胞核在固定处理后形状大小和强度几乎不变,因此选择细胞核作为实验对象。T1/2 是用激光将发射光的强度漂白到50%所用的时间 。 GFPSpark® 在488 nm 激光下的 T1/2 是12.4 s,EGFP 是 9.2s。GFPSpark® 光稳定性优于 EGFP。

GFPSpark® 基因表达

GFPSpark®,EGFP, 商业 GFP1 和商业 GFP2 重组质粒构建到 pCMV3 载体上。瞬时转染 293H 细胞,在激发光通道 455~495 nm波长激发下可以用荧光显微镜观察到绿色荧光。 在转染 24h、48h 和 96h 后,均观察到 GFPSpark® 具有更强的荧光信号。

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