橙/红色荧光蛋白 OFPSpark®

橙(红)色荧光蛋白 OFPSpark® 是 DsRed 的一种衍生物,OFPSpark® 由 231 个氨基酸组成,分子量为 26.4 kDa。OFPSpark® 激发波长和最大发射波长分别是 549 nm 和 566 nm。具有很高的光稳定性和 pH 稳定性。OFPSpark® 快速成熟,转染 8h 后就能清楚的在哺乳动物细胞中检测到荧光。OFPSpark® 可在多种生物中表达,没有细胞毒性,没有蛋白聚集现象。由于 OFPSpark® 是单倍体,非常适用于融合蛋白和细胞器标记。

橙/红色荧光蛋白 OFPSpark® 的优势

更亮的橙/红色荧光 pH 值稳定性好
极强的光稳定性 自主研发
快速成熟 推荐用于基因表达分析,细胞器和亚细胞结构标记
  • OFPSpark® 荧光图谱
  • SDS-PAGE 凝胶电泳分析
  • OFPSpark® 产品图片

与商业化橙色荧光蛋白 Red 相比,OFPSpark® 具有更强的荧光

DsRed 商业化橙色荧光蛋白 Red OFPSpark®
四聚体
不适合融合蛋白表达
单体 更亮

OFPSpark® 的主要特性

  荧光颜色 消光系数
(M-1cm-1)
量子产率 光强 Pka 结构 30℃条件下成熟速度 漂白t1/2 (s)
OFPSpark® 橙/红 84000 0.69 58 6.2 单体 4.7
商业化橙色荧光蛋白 橙/红 49000 0.6 29.4 6.8 单体 4.8

荧光光谱特征

A)消光系数:

B)光强:

荧光光谱用 Varian Cary Eclipse 荧光分光光度计进行测量,量子产率和吸收光谱用 Cary UV-Vis 分光光度计测量,蛋白质浓度用 BCA 法进行测量。OFPSpark® 激发光谱是 549nm,发射光谱是 566nm。 OFPSpark® 量子产率是 0.69, 商业化橙色荧光蛋白量子产率是 0.60。OFPSpark® 消光系数是 84000,商业化橙色荧光蛋白消光系数是 49000。OFPSpark® 消光系数优于商业化橙色荧光蛋白。

成熟时间

OFPSpark® 与商业化橙色荧光蛋白分别构建到 pCMV3 表达载体上瞬时转染 HeLa 细胞。转染前控制 DNA 的浓度相同,转染后在不同时间用荧光显微镜拍照观察。24h、48h、72h 和 96h 的荧光照片表明,OFPSpark® 的成熟时间与商业化橙色荧光蛋白相同。

pH 稳定性

OFPSpark® pH 的敏感性用96孔板进行试验,取100 µl 溶解在弱缓冲液中的 OFPSpark® 蛋白,加到100 µl 的强酸碱缓冲液中(总体积为 200µl)。测试pH从2到12,每个pH做3个孔的平行试验,测定每个孔的荧光亮度。最佳 pH 条件下荧光亮度的 50% 荧光值所对应的 pH 为 OFPSpark® 的 pKa。OFPSpark® 的 pKa 是6.2。商业化橙色荧光蛋白的 pKa 是6.8。

光漂白试验

用激光扫描共焦显微镜(LSCM)对 OFPSpark® 进行光漂白实验 。用表达载体瞬时转染 HeLa 细胞,36h 后进行拍照。然后使用 60x 油镜(CFI Apo TIRF,NA = 1.49)进行光漂白,将激光(561nm)调节至 8mW 的输出功率。仪器(A1,Nikon)被设置为 60X 的变焦,23.94μm2(5.7μm×4.2μm),80V 的光电倍增管电压,扫描时间为每帧1.5秒。细胞核在固定处理后形状大小和强度几乎不变,因此选择细胞核作为实验对象。T1/2 是用激光将发射光的强度漂白到 50% 所用的时间 。 OFPSpark® 在561 nm激光下的 T1/2 是 4.7s 而商业化橙色荧光蛋白的 T1/2 是 4.8s。OFPSpark® 光稳定与商业化橙色荧光蛋白相同。

GFPSpark® 基因表达

GFPSpark®,EGFP, 商业 GFP1 和商业 GFP2 重组质粒构建到 pCMV3 载体上。瞬时转染 293H 细胞,在激发光通道 455~495 nm波长激发下可以用荧光显微镜观察到绿色荧光。 在转染 24h、48h 和 96h 后,均观察到 GFPSpark® 具有更强的荧光信号。

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